ELISA加样、包被物质及其浓度
加样：在ELISA中除包被外，一般需要进行4－5次加样．在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴，此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加液姿势，使每滴液体的体积基本相同．在定量测定中加样量力求准确．标本和结合物的稀释液应按规定配制．加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡．
包被物质及其浓度：在ELISA中，将抗原或抗体固定在载体表面，称为固想的包被或包埋，固想包被的质量直接关系到酶免疫测定法的测定结果．理想的包被应该是：固相表面应该吸附尽可能多的特异抗体(或纯抗原物质)；吸附应较牢固，能耐受数次洗涤；非特异性吸附作用要小．具体操作中应考虑下述因素：包被物质及包被浓度，包被缓冲液的pH及离子强度，包被温度，时间及洗涤等．
抗原或抗体吸附于固相，吸附能力有差异．固相包被的机制有三种：第一种是物理性吸附，即抗原或抗体通过物理力被动地吸附于疏水性固相载体的表面，物理性吸附的过程较简单，不发生化学反应，不需特殊条件，适用于多种类型和型式的载体，如聚苯乙烯试管及酶标板凹孔，纤维素膜等，目前使用最广泛； 第二种是共价交联，先让物理惰性物质(固相)接上化学性质活泼的基团，通过该基团再把抗原或抗体与固相载体交联，引入的活性基团常 为戊二醛．滤纸亦可作为固相，先用溴化*激活纸质纤维素，再与抗体交联，用化学交联法制得的固相，其吸收容量大，批号之间的差异小，而且价格低廉，用共价法交联可能是固相包被标准化的最佳途径； 第三种是交联于蛋白质，应用极少．
固相抗体与固相表面的吸附是通过物理作用．糖蛋白类物质如癌胚抗原，血型物质，脂蛋白，细菌脂多糖，糖脂及变性DNA，均可吸附于聚苯乙烯塑料表面，而天然DNA，中性多糖用于包被塑料固相表面的效果不佳或背景着色深．有人认为聚苯乙烯吸附抗原好，聚乙烯吸附抗体效果好．有一些预处理固相板的方法可以改善吸附，如厂家用射线照射，使用者用乙酸，盐酸，戊二醛或多聚赖氨酸处理板．用戊二醛和盐酸预处理板不仅促进吸附，还能降低非特异性反应，用多聚赖氨酸可增强某些多糖抗原的吸附．
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