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文献解读 | 结合单细胞和空间转录组揭示乳腺癌传播过程中的代谢演变

作者:上海伯豪生物技术有限公司 暂无发布时间 (访问量:2342)

期刊:ADVANCED SCIENCE 

影响因子:17.521

 

导语

乳腺癌已成为全球范围内最常见的恶性肿瘤,占女性癌症的近30%。由于治疗手段的快速发展,大多数非转移性乳腺癌患者是可以治愈的。腋窝淋巴结状态是决定治疗策略的重要临床因素,在风险评估和预后评估中也具有重要意义。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一个强大的工具,可以在单个细胞的分辨率下提供人类癌症的表达谱。空间转录组学(ST)是一种新型的生物技术,可以在组织切片中以空间分辨率进行可视化和定量分析,弥补scRNA-seq中空间信息的不足。ST结合scRNA-seq有助于克服scRNA-seq(缺乏空间信息)和ST(不是单个细胞分辨率)的局限性。

 

研究技术

单细胞转录组测序,空间转录组测序

 

研究内容

本研究利用单细胞RNA测序( scRNA-seq )和空间转录组学技术对4例乳腺癌患者及其配对的腋窝转移淋巴结的65,968个细胞进行了分析。鉴定了一个具有高水平氧化磷酸化(OXPHOS)的播散性癌细胞簇。研究发现,当扩散启动时,糖酵解和OXPHOS之间会发生转变。此外,这种独特的细胞簇沿肿瘤前缘分布,后续对发现进行了验证。

 

研究路线图

 

研究结果

1. 乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶单细胞图谱

为了全面鉴定原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中的细胞组成和结构,本研究对4例患者手术切除的4对原发浸润性乳腺肿瘤和转移腋窝淋巴结进行了scRNA-seq(10x Genomics)。通过严格的质量过滤,对剩余的65,968个细胞进行了单细胞图谱的构建。通过聚类,所有的细胞被分为了0-15个cluster(图1B),通过marker基因将所有细胞分为8种细胞类型,包括上皮细胞(ECAM1、KRT19、PROM1)、浆细胞(IGHG1、MZB1、SDC1)、髓系细胞(CD68、CD163、CSF1R、MRC1、TPSAB1、MS4A2、CD1C)、 NK细胞(NCR1、GLNY、NKG7)、B细胞(CD79A、CD79B、MS4A1)、T细胞(CD3D、CD3E、CD8A、CD4)、成纤维细胞(COL1A1、COL1A2、DCN)、内皮细胞(PCAM1、VWF)(图1C、D)。

Fig 1. 乳腺癌原发灶和转移灶的单细胞图谱

2. 通过scRNA-seq鉴定上皮细胞特征

由于癌细胞来源于上皮细胞,本研究对上皮细胞细分为了11个亚群。为了区分恶性细胞和非恶性细胞,本研究对于上皮细胞和上皮细胞亚群进行了CNV水平的评估。在所有上皮细胞簇中,C3的CNV水平明显低于其他细胞簇,表明C3是一组正常的乳腺导管上皮细胞,而其他细胞簇是恶性上皮细胞(图2B)。为了解析乳腺癌上皮细胞的进化动态,对上皮细胞的11个cluster进行了拟时序分析。因为C3为非恶行细胞,且在轨迹曲线的右下角,证明拟时序分析的右下角为起点。因此,C2、4和9被鉴定为早期扩散的癌细胞(EDC)簇,因为它们位于轨迹曲线的末端,具有相对较高的CNV水平(图2B、C)。更重要的是这三群在原发肿瘤和淋巴结样本中均有出现。尽管C8的CNV水平较低,但因为其在原发肿瘤和淋巴结样本中均有出现,也被定义为EDC簇。总之,研究确定了C3代表正常乳腺导管上皮细胞,而C2、4、8和9是乳腺癌的EDC簇。

为了研究EDC簇(C2 , 4 , 8 , 9)的基因表达变化,基于分子特征数据库(Molecular Signatures Database,MsigDB)的Hallmarker基因集进行富集分析,以识别癌细胞在传播过程中的变化途径。富集程度最高的通路包括与细胞增殖相关的通路(mTORC1 signaling、MYC targets V1)和乳腺癌治疗反应相关的通路(estrogen response early, estrogen response late),这些通路与患者的临床病理特征和EDC簇更多的恶性特征相符。另外,EDC簇显示OXPHOS途径的显著富集,暗示扩散细胞的新的代谢特征(图2D)。

热图(图2E)显示了细胞分化过程中基因表达变化。其中在恶性上皮细胞早期播散过程中,OXPHOS (COX6C、DHRS2、ATP5MC2和NDUFB4)中的标记基因呈现先上调后下调的表达模式,而糖酵解途径中的标记基因(GAPDH、LDHA、PKM和PGK1)呈现先下调后上调的表达模式。同时,与细胞粘附和迁移相关的基因(CLDN3, F11R)的表达也呈现先下降后上升的模式,这表明了癌细胞在扩散过程中细胞行为的动态变化。乳腺癌细胞的这种代谢转换类似于转移过程中上皮间质转化(EMT)的变化,即从原发肿瘤脱离后,EDCs的代谢轮廓从糖酵解转变为OXPHOS。一旦转移细胞形成,代谢偏好又恢复为促进细胞增殖。总之,我们的研究结果揭示了乳腺癌早期转移过程中OXPHOS和糖酵解之间的转变,表明OXPHOS可能在转移过程中发挥重要作用。

Fig 2. 上皮细胞特征

3. 细胞通讯分析揭示EDCs与免疫细胞之间的细胞间配体-受体对

为了鉴定EDC与免疫细胞之间的相互作用关系,本研究对EDC和免疫细胞做了cellchat分析。虽然在原发肿瘤中主要细胞类型之间的相互作用数量较高,但两组之间的相互作用强度非常接近(图3A)。EDC簇在原发肿瘤中表现出与免疫细胞更多的相互作用,而在淋巴结中表现出与免疫细胞更强的相互作用(图3B-E)。

接下来研究了不同细胞簇之间的特异性配体-受体相互作用。免疫细胞之间的配体-受体对(CD22 - PTPRC、PTPRC - CD22和ADGRE5 - CD55)在淋巴结相比于原发肿瘤中显著上调,表明这些途径对于肿瘤的免疫反应至关重要。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)通路在EDCs和免疫细胞之间的淋巴结和原发肿瘤中都很活跃,表明它在这两个部位都是必不可少的,并且可能有助于乳腺癌的传播(图3F-H)。20条通路中,有4条通路在原发和转移中都活跃,其他的一些通路分别存在淋巴结或者原发肿瘤中(图3I)。

Fig 3. EDCs细胞通讯

4. 空间转录组测序联合单细胞测序解释EDC的空间特征

为了进一步评估上皮细胞的空间组织,从4例患者的原发新鲜肿瘤样本中进行乳腺癌组织冰冻切片。经苏木精-伊红(H & E)染色和明场成像后,将玻片注释为3个主要区域,包括肿瘤区域、导管上皮和基质区域(图4A左)。为了详细探究EDC簇的空间特征,利用t - SNE分析对ST数据进行处理,将所有spot划分为15个Cluster(图4B)。通过将所有ST簇投射到冰冻切片上,研究发现了一个明显的分布模式,这与H & E染色(图4A ,右)下的组织学注释一致。对于每个样本,肿瘤区域由不同的簇组成,包括来自T1的CII,来自T2的CX和CXIV,来自T3的CIX和CXIII,来自T4的CVIII和CXV。这些结果暗示了4例患者之间的肿瘤异质性。为了精确定位样本中的上皮细胞,应用MIA生成上皮簇和ST簇的对应关系。我们发现EDC簇(C2,C4,C8,C9)在肿瘤区域富集。有趣的是,我们注意到在T3和T4中,EDC簇C2和C8主要位于肿瘤区域的前沿,而在T3中,另一个恶性细胞(C6)被C8包围。结合伪时间分析的结果,推测从恶性阶段(C6)到播散阶段(C8)的演变与从肿瘤内部到前缘最后到转移部位的路线平行。为了验证这一假设,手动选取了每个样本肿瘤前缘的斑点。对不同样本进行了BMS、OXPHOS、EMT评分,尽管在四个样本中三个评分有差异,但在每个样本中,三个评分在肿瘤前缘显示出明显高于肿瘤内部区域(图4D、E)。这些结果表明EDC簇的分布遵循肿瘤前沿,这与MIA产生的结果以及scRNA-seq鉴定的EDC簇代谢特征一致。

为了进一步研究肿瘤前沿的EDCs,我们对T3和T4的ST数据进行了t - SNE分析,将每个样本的spot点重新聚类为9个簇和5个簇 (图4F,左)。BMS评分最高的两个簇(C2在T3,C4在T4)在两个样本中均沿肿瘤前缘分布(图4F中、4G)。根据scRNA - seq的结果,COX6C和DHRS2在EDC簇和其他上皮簇之间的前25个差异基因中,均参与OXPHOS途径。正如预期的那样,在两个样本中,COX6C和DHRS2水平最高的两个簇沿肿瘤前缘分布,这与MIA产生的结果一致。

GSVA 分析肿瘤前沿spot与肿瘤区域其他spot之间的差异通路。GSVA结果显示OXPHOS通路在肿瘤前沿的spot中显著上调。此外,其他富集通路如DNA修复通路、MYC靶点V1通路和mTORC1信号通路在EDC簇中也显著上调。综上所述,研究发现EDC簇趋向于沿肿瘤前缘分布,并表现出OXPHOS上调的代谢特征。OXPHOS可能在EDC簇的代谢转化中发挥重要作用。

Fig 4. EDC的空间特征

5. 敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和EMT评分

使用不同的人乳腺癌细胞系敲除了氧化磷酸化通路中的关键基因COX6C和DHRS2基因,并结合transwell细胞迁移实验、免疫组化(IHC)、WB实验等,发现敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和EMT评分。

Fig 5. 敲除COX6C和DHRS2抑制乳腺癌细胞增殖

6. Oxphos的上调与乳腺癌患者的淋巴结状态和预后相关

作者接下来用自己的FUSCC队列数据和TCGA数据库相结合分析,发现淋巴结转移阳性样本在OXPHOS通路上得分更高,在糖酵解途径得分更低。scRNA-seq公共数据集分析验证发现OXPHOS通路、雌激素信号通路和tight junction通路在EDC细胞中富集。TCGA生存分析发现,在HER2阳性乳腺癌中和基底样乳腺癌中,COX6C和DHRS2与较差的OS(overall survival)和DMFS(distant metastasis-free survival)相关。

Fig 6. 氧化磷酸化与乳腺癌患者淋巴结转移和预后呈正相关

参考文献:

Liu Y M, Ge J Y, Chen Y F, et al. Combined Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal the Metabolic Evolvement of Breast Cancer during Early Dissemination[J]. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), e2205395.

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