论文标题：Encodinggene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA andcontributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinomavia inducing autophagy
发表杂志：Cell Death and Disease（IF=8.469）
作者院校：中南大学湘雅三医院
实验方法：环状DNA circle-seq、全转录组测序、环状 DNA Sanger 测序、环状 DNA qPCR 验证(均由云序生物提供服务)
下咽鳞癌（Hypopharyngeal squamous cell carcinoma ，简称HSCC）是头颈鳞癌（ Head and neck squamous cell carcinoma，简称HNSCC）的一种，这种疾病预后差，而发病率却在快速上升。顺铂（Cis-Diamino-Dichloro-Platin，简称 Cisplatin 或 DDP）是一种常用于治疗下咽鳞癌的化疗药物，但细胞自噬却会赋予肿瘤顺铂抗药性，对下咽鳞癌的治疗带来不利影响。本文作者使用了下咽鳞癌细胞系FaDu 和具有顺铂抗药性的下咽鳞癌细胞系FaDu/DDP 作为实验对象，进行了环状 DNA 的circle-seq以及全转录组测序，并通过 Sanger 测序和 qPCR 验证了 RAB3B 基因所在的环状 DNA 的真实存在，发现 eccDNA 上的 RAB3B 基因可通过诱导细胞自噬而赋予下咽鳞癌细胞顺铂抗性。下面我们就来了解一下本文的具体研究思路：
eccDNA 表达谱
研究者首先研究了FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞的 eccDNA 表达谱（生物学重复 3 vs 3）。云序生物提供了 eccDNA 的circle-seq服务：细胞样品中的 DNA 被提取后，通过 A&A 环状 DNA 纯化柱纯化，而后外切酶消化线性 DNA，随后对剩余的环状 DNA 进行滚换扩增，最后经过超声打断后建库测序。在FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞中均有检测到一万个左右的 eccDNA，其中有几千个 eccDNA 含有基因。研究者还对 eccDNA 的长度进行了统计，发现其分布范围从 0.01 kb 到 1000 kb 不等，但在 0.1 kb 和 0.7 kb 附近有两个明显的长度峰的存在。以上这些 eccDNA 表达谱特征在 FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞都很相似。
在具有抗药性的FaDu/DDP 细胞中，很大比例（2366/9773）的 eccDNA 上没有基因，较大比例（1958/9773）的 eccDNA 上仅有 1 个基因，但也有 4 个 eccDNA 上具有多达 8 个基因。绝大多数的 eccDNA 基因（3779/5201）仅在 1 种 eccDNA 上发现，但也有 5 个基因在多达 6 种 eccDNA 上发现，甚至更有 1 个基因（CUX1）在多达 8 种 eccDNA 上发现。在 FaDu 细胞中也可以观察到类似的 eccDNA 基因分布趋势。
图1. FaDu 细胞和FaDu/DDP 细胞的 eccDNA 表达谱特征
抗药细胞系的 eccDNA 表达特征
研究者还进一步比较了FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞的 eccDNA 在各条染色体上的分布，除了个别染色体以外，整体而言没有发现两个细胞系之间的明显差异。在各条染色体之间比较 eccDNA 的分布密度，发现基因密度高的 19 号染色体具有最高的 eccDNA 密度，而基因密度低的 Y 染色体则具有最低的 eccDNA 密度。
在FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞之间，找出了 1163 个 eccDNA 上的 2307 个差异表达的 eccDNA（Differentially Expressed EccDNAs，简称 DEEDs）。根据这些 DEEDs 进行的 KEGG pathway 和 GO 生物信息学分析显示，多个与抗药性相关的 KEGG 通路中存在显著上调或下调的 DEEDs 上的基因，多个与细胞抗药性相关的 GO 条目也富集有 DEEDs 上的基因，提示FaDu 细胞和 FaDu/DDP 细胞之间的 eccDNA 基因表达差异可能是导致其抗药性差异的原因。
图2.差异表达的 eccDNA 和基因
转录谱与 eccDNA 表达谱之间的联合分析
研究者除了进行 circle-seq 检测 eccDNA 以外，还对 FaDu 细胞和具有抗药性的FaDu/DDP 细胞进行了全转录组测序。将全转录组测序和 circle-seq 进行联合分析，就可以找出两种细胞系之间 mRNA 表达量发生显著变化且 eccDNA 量也发生显著变化的基因。其中共找到了 7 个 eccDNA 上的 24 个序列完整的基因，它们的 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著上调；10 个 eccDNA 上的 11 个序列完整的基因，它们的 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著下调。
验证 eccDNA 的真实存在
为了验证 circle-seq 中分析出的 eccDNA 是否真的以环状的形式存在，研究者选用多个不同类型的 eccDNA 进行了成环位点的Sanger测序验证以及环状 DNA 的qPCR 验证实验。实验结果证明，三个带有蛋白编码基因的 eccDNA 都在细胞中真实存在。其中有一个被证明真实存在的环状 DNA 上带有 RAB3B 基因。
图3.含有 RAB3B 完整基因的 eccDNA 被验证真实存在
抗药性是因为 RAB3B 基因引起的
为了找出导致FaDu/DDP 细胞抗药性的关键基因，研究者选取了数个 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著上调的基因，分析它们的基因表达量与 GEPIA 和 TCGA 数据库中 HNSCC 患者的总生存率之间的关系，结果发现仅有 RAB3B 基因与患者的总生存率呈负相关。GEPIA 和 TCGA 测序数据库中的信息还显示，HNSCC 组织中的 RAB3B 基因的表达量也发生了显著上调。因此，研究者认为 RAB3B 基因很可能是导致 HNSCC 患者抗药性和低生存率的原因。为了验证这一假设，研究者随后以 RAB3B 基因为变量，研究 RAB3B 基因与顺铂抗药性之间的关系。
图4. RAB3B 基因关联较差的 HNSCC 疾病预后以及较强的 DDP 抗药性
RAB3B 可诱导下咽鳞癌细胞产生自噬介导的抗药性
RAB3B 属于小G蛋白 RAB 家族，参与了细胞自噬和抗药性的生物过程，作为一个癌基因在多种癌症中被发现报道，但先前并无科学家证明过 RAB3B 在 HSCC 中的致病作用。
本篇论文的研究者用 qPCR 以及 Western Blot 的方法在 FaDu 和 FaDu/DDP 细胞中检测了 RAB3B 的 mRNA 和蛋白表达水平，发现其在抗药性细胞FaDu/DDP 当中的表达显著上调。通过 shRNA 敲降和质粒过表达来降低或升高FaDu/DDP 细胞中的 RAB3B 的表达水平，研究者发现敲降 RAB3B 将会降低细胞对 DDP 的抗药性（IC50 降低），而过表达 RAB3B 则会升高细胞对 DDP 的抗药性（IC50升高）。同时，对细胞自噬标志物 LC3-I 和细胞自噬特异性底物 p62 的 Western Blot 检测结果显示，细胞自噬标志物 LC3-I 到 LC3-II 的转化在 RAB3B 表达时上调，而自噬特异性底物 p62 则在 RAB3B 表达时下调，说明 RAB3B 可以促进细胞自噬的发生。电镜观察显示，RAB3B 敲降细胞中的自噬囊泡显著减少，也说明 RAB3B 可以促进细胞自噬的发生。研究者还构建了下咽鳞癌的肿瘤类器官（ Patient-derived tumor organoid，简称 PDO），结果发现顺铂药物处理加上 RAB3B 敲降可对下咽鳞癌 PDO 造成最大程度的打击。
综上可以得出结论，在体外环境下，RAB3B 可以诱导细胞自噬，进而产生顺铂抗药性。
图5. RAB3B 可诱导下咽鳞癌细胞产生自噬介导的抗药性
小结
本论文的研究者通过环状 DNA 测序/circle-seq 和全转录组测序联合分析，找到了一个包含 RAB3B 基因完整序列的 eccDNA 在顺铂抗性细胞系中显著高表达。体外实验可以证明，RAB3B 可以通过细胞自噬机制赋予细胞顺铂抗药性。由此，研究者推论认为，很可能是因为 RAB3B 的 eccDNA 高表达，转录翻译了大量的 RAB3B 蛋白，通过有诱导细胞自噬机制，最终赋予了细胞顺铂抗药性。
图6. eccDNA在FaDu细胞的DDP抗性中的作用和机制示意图
云序生物 eccDNA 测序
云序生物是国内最早提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状 DNA 测序技术的开发。2019年，云序率先发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了血清血浆环状DNA测序及血清血浆环状DNA甲基化测序服务，均为全国首发，并成为国内环状DNA产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。云序生物 eccDNA 相关产品
1.组织细胞环状DNA测序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。
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- 使用原装A&A biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
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云序生物eccDNA测序实验示意图
2.血清血浆环状DNA测序
针对血清血浆微量样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
技术优势：
- 减少DNA损失
- 保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确
3.血清血浆环状DNA甲基化测序
针对血清血浆样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。
- 一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
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针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。
5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯一总代理。
云序生物服务优势
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