文献解读 | 肝肿瘤免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性-技术前沿-资讯-生物在线

文献解读 | 肝肿瘤免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性

作者:上海伯豪生物技术有限公司 2024-01-23T00:00 (访问量:7054)

期刊:NATURE

影响因子:64.8

主要技术:单细胞转录组测序(scRNA-seq),全外显子组测序(WES),ATAC-seq(染色质可及性分析)

 

导语

肿瘤免疫微环境(TIME)的异质性,是影响肿瘤转移、复发和耐药的主要因素,不同的TIME亚型与肝癌的临床相关性尚不清楚。本研究对124名肝癌患者和8只肝癌小鼠的189个样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过分析超过100万个细胞,作者将PCL患者分为五种TIME亚型:免疫激活型、髓细胞或基质细胞介导的免疫抑制型、免疫排斥型和免疫滞留型。不同的TIME亚型具有特殊的空间分布特征,趋化因子网络和基因组特征。此外,在髓细胞亚型中富集的肿瘤相关中性粒细胞(TAN)群体与不良预后相关。通过体外诱导TANs和体外分析患者TANs,作者发现CCL4+ TANs可以招募巨噬细胞,PD-L1+ TANs可以抑制T细胞的细胞毒性,且在人类中性粒细胞亚群中具有相似的特征。小鼠模型体内中性粒细胞耗竭可减弱肿瘤进展,证实了TANs的促肿瘤表型。通过详细分析肝癌细胞异质性,阐明了不同TIME亚型的特征,强调了TANs的免疫抑制功能,并揭示了针对TANs的潜在免疫疗法。

 

研究技术

单细胞转录组测序(scRNA-seq),全外显子组测序(WES),ATAC-seq(染色质可及性分析)

 

研究结果

1. 肝癌的大规模单细胞图谱

为研究原发性肝癌(PCL)的TIME,作者对124例未接受治疗的患者的160个样本进行了scRNA-seq分析,其中包括79例HCC, 25例ICC和7例CHC(图1a)。获得了1,092,172个细胞中,鉴定出89个TIME细胞簇(图1b,c)。TIME细胞簇表现出明显的组织和癌症类型特异性。拷贝数分析显示,大多数上皮细胞为肿瘤细胞,具有患者特异性。

图1 PCL单细胞图谱

2. 细胞模块分析揭示了5种TIME亚型

为了研究PLC的TIME亚型,作者检测了肿瘤组织细胞的共富集模式。层次聚类识别出5个稳定的细胞模块(CM1-CM5)(图2a),作者将患者分为5个相应的TIME亚型(图2b-e),并从以下4个方面对每个亚型做了具体分析:(1)细胞组成,(2)功能标记基因表达,(3)时间相关基因特征,(4)预后相关性。

CM1中含有活化的骨髓细胞和T细胞簇,CM1优势患者表现出免疫激活状态,因此被指定为TIME-IA(免疫激活)。CM2中与免疫抑制富集的“骨髓细胞免疫抑制”和“促肿瘤细胞因子”特征有关,并且与较差的预后相关,被指定为TIME-ISM(免疫抑制髓系)。基质细胞均在CM3和CM4中富集。CM3中高表达肿瘤激活的基质基因,预后较差,指定为TIME-ISS(免疫抑制基质)。而CM4含有大量内皮和间充质细胞,缺乏免疫细胞,被命名为免疫排斥表型(TIME-IE)。CM5含有肝驻留细胞簇,包括驻留型自然杀伤细胞(NK_05_CD160) Kupffer细胞(Mph_01_MARCO)和肝窦内皮细胞(EC_01_CLEC4A),与较好的预后相关。因此,CM5优势患者被指定为TIME-IR(免疫驻留)。这些TIME亚型表现出不同的趋化因子网络,并与肿瘤细胞的不同体细胞突变和转录组谱相关。

作者将以上分类方案命名为TIMELASER,用于区分肿瘤免疫微环境亚型。将这种分类方法应用于空间转录组数据和已发表的scRNA-seq、bulk RNA-seq数据集,均能得到与本文相似的TIME亚型。这些结果验证了本文提出的TIMELASER分类法,并进一步证明该分类法在空间分辨率和bulkRNA数据分析上的有效性。

图2解析PCL的5种TIME亚型

3. 肝癌中性粒细胞异质性

由于中性粒细胞比较脆弱,基因含量少,单细胞测序中难以捕获,而TIME-ISM(CM2)中多种中性粒细胞亚群的富集、与不良预后的关联促使作者进一步研究中性粒细胞。34,307个中性粒细胞被分为11个亚群,这些亚群表现出明确的组织分离和癌症类型偏好,主要可分为外周血中性粒细胞(PBNs)、邻近肝脏中性粒细胞(ALNs)、肿瘤中富集的中性粒细胞(TANs)。拟时序分析揭示了中性粒细胞从PBN到ALN再到TAN的明确分化路径(图3a)。

值得注意的是,TIME-ISM中三个TAN亚群的组合比例较高(Neu_09/10/11,平均占总TAN的86.8%),与较差的预后相关,暗示这些TAN具有促肿瘤功能。作者重点关注了两个TANs亚群Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1的表型和功能。通过mIHC证实,CCL4+ TANs (Neu_11_CCL4)高表达趋化因子相关基因CCL3和CCL4(图3d)。一系列体外实验证实TANs具有趋化因子分泌功能,支持CCL4+ TANs可以招募巨噬细胞的观点。作者还发现,与非TANs相比,TANs中CD274(编码PD-L1)的表达显著增加,其中Neu_09_IFIT1的表达量最高(图3i)。为了研究高PD-L1表达的TANs是否会直接抑制T细胞活性,作者将CD8+ T细胞与体外诱导的TANs或患者衍生的TANs共培养。与体外诱导的TANs共培养的CD8+ T细胞中,T细胞细胞毒性标记物IFNγ和活化标记物CD25和CD69的蛋白水平降低(图3n)。在加入抗PD-L1抗体后, IFNγ的下降被逆转(图3o),证实PD-L1介导了TANs的抑制功能。

图3中性粒细胞异质性

4. 人类和小鼠肝癌中的保守中性粒细胞亚群

为了进一步研究TANs的异质性,作者建立了两种新的自发性肝癌小鼠模型,pTMC小鼠主要发展为HCC, pTMK小鼠主要发展为ICC。作者对来自6只小鼠的21个样本进行了scRNA-seq分析,包括外周血、肿瘤邻近肝脏和肿瘤。17,780个中性粒细胞被分为12个簇,显示出明确的组织特异性和有序的发育轨迹(图4a、b)。TIME-ISM (hNeu_09/10/11)中的三个TAN子集分别对应于mNeu_10/11/12。Cd274在小鼠TANs高表达,与人类TANs一致(图4d)。通过无偏倚的整合跨物种数据,分析关键特征基因,作者发现小鼠和人的中性粒细胞在很大程度上保守(图4c),这一发现为在小鼠模型中研究中性粒细胞为基础的治疗奠定了基础。

图4 小鼠模型中的中性粒细胞异质性

5. 中性粒细胞耗竭延缓肿瘤生长

由于TIME-ISM TANs的促肿瘤表型(Neu_09/10/11),作者进一步探究了在体内消除这些促肿瘤TANs亚群的治疗效果。使用抗ly6g抗体消耗中性粒细胞后,患癌小鼠的肝癌结节和肿瘤重量显著减少(图4e,f)。与同型对照相比,抗ly6g处理后的TANs数量和TANs的PD-L1表达均下降(图4)。此外,作者观察到浸润性巨噬细胞减少46.6%。虽然Ly6G阻断并没有改变CD8+ T细胞的数量,但它们的衰竭状态得到了缓解。总的来说,中性粒细胞耗竭可以减弱巨噬细胞募集和T细胞抑制,从而抑制肿瘤生长。

 

结论

本研究通过大规模,免分选的单细胞分析全面描绘了PLC的细胞图谱,识别到五种TIME亚型,解析了中性粒细胞异质性。TIMELASER框架涵盖了大多数细胞群,可对TIME亚型无偏分类。作者推测,对这些数据的深入分析,将为肿瘤- TIME和TIME-TIME串扰提供新的见解,有助于识别免疫细胞功能,指导我们去发现PCL的生物标志物或免疫治疗靶点。本文深入研究了中性粒细胞的异质性及其功能,确定了人类和小鼠之间广泛保守的中性粒细胞谱。TANs具有促肿瘤作用,作者推测CCL4+、SPP1+和PD-L1+ TANs是有希望的免疫治疗靶点。进一步探索中性粒细胞对免疫治疗的影响及其相关的临床混杂因素,将为更好地了解TAN生物学特性,提出肝癌治疗的转化研究途径提供新的机会。

 

参考文献:

[1] Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al (2022) Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature 612:141–147. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x

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