串联质谱鉴定蛋白质是将蛋白样品酶解为肽段，再通过 LC-MS/MS 采集肽段母离子和碎片离子信息，最后利用数据库检索或谱图解析确认蛋白身份的方法。它适用于蛋白提取物、SDS-PAGE 条带、2D 胶点、IP 样品、pull-down 样品和 co-IP 样品中的蛋白鉴定，也可用于未知蛋白线索分析、肽段覆盖验证和部分修饰位点判断。

关键要点

它是什么？

蛋白串联质谱分析的核心逻辑是“蛋白先变成可测肽段，肽段谱图再反推蛋白”。样品中的蛋白通常先经胰蛋白酶等酶切成肽段，肽段经纳升级液相色谱分离后进入质谱仪。仪器先采集一级质谱确定肽段母离子，再选择母离子进行二级碎裂，得到 MS/MS 碎片谱图。

数据分析软件会把实验谱图与数据库中理论蛋白酶切肽段进行比对。如果多个高质量肽段都指向同一个蛋白，且满足质量误差、碎片匹配、唯一肽段和假阳性控制要求，就可以给出较可信的蛋白鉴定结果。

图 1. 串联质谱通过肽段母离子选择、碎裂和数据库匹配确认蛋白身份。

蛋白串联质谱分析的流程

典型流程包括样品前处理、蛋白酶解、肽段净化、LC-MS/MS 采集、数据库检索、FDR 控制和结果解释。对于胶点或胶条样品，通常需要先进行胶内酶解；对于 IP、co-IP 或 pull-down 样品，需要同时关注目标蛋白、结合蛋白和背景污染蛋白；对于总蛋白提取物，则可能采用 Shotgun 策略进行大规模蛋白鉴定。

图 2. 蛋白串联质谱鉴定需要把样品处理、LC-MS/MS 采集和数据库检索串成完整证据链。

主要优势

1、可从复杂样品中确认蛋白身份

LC-MS/MS 能在复杂背景中分离并采集大量肽段谱图，适合总蛋白提取物、免疫沉淀样品和胶点样品中的蛋白鉴定。

2、结果证据更具体

相比只看分子量或条带位置，MS/MS 提供肽段序列层面的证据。唯一肽段越多、覆盖度越高、匹配质量越好，蛋白身份通常越可靠。

3、可兼顾发现和验证

Shotgun 蛋白质鉴定适合发现未知候选蛋白；目标蛋白鉴定、胶点鉴定和 IP 样品鉴定更适合围绕具体候选对象进行验证。

主要局限

1、蛋白鉴定不是只看“是否有一个肽段命中”，需要结合唯一肽段数、覆盖度和 FDR。

2、数据库物种选择不准确会导致漏检或错误匹配。

3、高丰度蛋白、角蛋白和抗体链可能干扰 IP 或胶点样品结果。

4、低丰度、膜蛋白、极端理化性质蛋白可能需要更有针对性的前处理。

5、常规 bottom-up MS/MS 对同源蛋白、剪接异构体和高度相似家族成员的区分可能有限。

如何选择蛋白质谱鉴定方案？

如果样品是单一胶点或条带，重点是确认该位置主要蛋白，可选择胶点、胶条蛋白鉴定；如果样品来自 IP、co-IP 或 pull-down，重点是区分特异结合与背景蛋白；如果是复杂提取物，需要大范围识别蛋白组成，可使用 Shotgun 鉴定；如果目标是验证蛋白序列覆盖或生物药相关序列，则更适合 LC-MS/MS 全序列验证。

图 3. 蛋白质谱鉴定方案应根据样品复杂度、研究目标和结果解释需求选择。

FAQ

1、串联质谱鉴定蛋白质需要多少样品？

样品量取决于蛋白丰度、复杂度、前处理损失和仪器灵敏度。胶点、条带和 IP 样品通常需要尽量减少角蛋白污染，并保证可见或可检测的蛋白量。

2、一个肽段命中就能证明蛋白存在吗？

通常不建议只凭一个低质量肽段下结论。更可靠的结果应包含多个唯一肽段、良好谱图匹配、合理质量误差和受控 FDR。

3、IP 或 co-IP 样品能直接得到互作蛋白吗？

MS/MS 可以鉴定 IP 或 co-IP 样品中的蛋白，但互作判断还需要阴性对照、重复实验、背景扣除和后续验证。质谱结果更适合作为候选互作蛋白列表。

4、串联质谱能区分相似蛋白吗？

如果存在该蛋白特有的唯一肽段，可以区分；如果同源蛋白共享大部分肽段，常规 bottom-up 结果可能只能定位到蛋白组或家族层面。

5、数据库选择为什么重要？

数据库决定了谱图可以匹配到哪些理论蛋白。物种选错、数据库缺失或注释不完整，都会影响蛋白鉴定数量和准确性。

结论

串联质谱鉴定蛋白质通过“肽段碎片谱图到蛋白数据库匹配”的证据链，将复杂样品中的蛋白身份转化为可解释的数据结果。它适合蛋白条带、胶点、IP/co-IP、pull-down、总蛋白提取物和未知蛋白样品分析。要获得可靠结论，需要关注样品前处理、数据库选择、唯一肽段、谱图质量、FDR 和背景控制。对于低丰度、膜蛋白、相似蛋白或互作研究场景，应结合样品特点选择更合适的蛋白质谱鉴定方案。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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